プラスミドのシリカゲルによる精製
参考文献 11)
11) DNA Adsorption to and Elution from Silica Surfaces: Influence of Amino Acid Buffers (2014)
正に帯電した（アルギニン（ARG）とヒスチジン（HIS））、負に帯電した（アスパラギン酸（ASP）とグルタミン酸（GLU））、極性中性（GLU）に分類されるアミノ酸を含む溶液からシリカへのDNA吸着への影響を測定しました。アスパラギン（ASN）、グルタミン（GLN）、セリン（SER））、および非極性疎水性（ロイシン（LEU）、プロリン（PRO）、およびグリシン（GLY））。さらに、DNA抽出の固相として2種類のシリカ粒子を選択しました。最初のタイプであるMagPrepシリカコーティング磁性粒子（Merck）は、核酸の固相抽出に一般的に使用されます。ただし、これらの粒子のシリカ表面は、核酸抽出用に最適化されている可能がある
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4097040/
プラスミド精製特許
参考文献 12)
12) プラスミド精製 JP2007500711A – 特許 –
多孔のポアサイズを持つ陰イオン交換レジンによる精製。大きいサイズのプラスミドは、外表面に結合、プラスミドより小さいサイズの負電荷物は、プラスミドがアクセスできないボア内に結合させる。
背景情報には、>80%飽和硫酸アンモニウムによりpDNAを可溶性、ゲノムDNAを不溶性に分離できる特許情報の記載がある(米国特許第６２１４５８６号（Ｇｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｒｐ.)
https://patents.google.com/patent/JP2007525222A/ja
pDNAのCTAB精製
参考文献 13)
13) Milligram scale parallel purification of plasmid DNA using anion-exchange membrane capsules and
a multi-channel peristaltic pump (2007)低濃度CTAB (0.1-4g/L) 沈殿法によるpDNAとRNA/Endotoxinの分離 : 2g/L or 10g/L CTAB/50mM NaCl溶液を添加し、Incubation20分, cfg(38,000xg 20min, 20℃)/pptを70% EtOHで洗浄し、0.6M NaCl, 25mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH7.4で氷冷下で溶解。
https://www.researchgate.net/profile/Stefan-Schmidt-27/publication/6232344_Milligram_scale_parallel_purification_of_plasmid_DNA_using_anion-exchange_membrane_capsules_and_a_multi-channel_peristaltic_pump/links/59de01f545851557bde325bd/Milligram-scale-parallel-purification-of-plasmid-DNA-using-anion-exchange-membrane-capsules-and-a-multi-channel-peristaltic-pump.pdf
pDNAのHIC精製
参考文献 14)
14) Purification of plasmid (pVaxLacZ) by hydrophobic interaction chromatography (2005)
2.5M AmSO4(硫酸アンモニウム)で沈殿化した後、HICでBindingさせ、1.5M AmSO4でElutionする。
https://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1516-89132005000400014
参考文献 15)
Using a single hydrophobic-interaction chromatography to purify pharmaceutical-grade supercoiled plasmid DNA from other isoforms (2012)
1. HICカラムにより抽出したpDNAを不純物であるタンパク質、RNA、エンドトキシンなどの宿主汚染物質から分離精製する
2. scpDNAとocpDNAを分離可能。
3. 3 M硫酸アンモニウムの存在下では、scpDNAはocpDNAよりも疎水性が高くなり、ocpDNAは最初にHICから溶出できることで、一部のocpDNAをscpDNAから除去可能
4. 効果的な免疫応答と感染性チャレンジからの保護を引き出すために高いスーパーコイルレベルが必要であることを示されている（Cupillard et al。、2005; Pillai et al。、2008）
5. 製品には細菌ゲノムDNA、RNA、タンパク質、エンドトキシンが含まれていない必要
6. 第二に、pDNA産物は高い均質性でなければなりません。つまり、ほとんどのプラスミドはスーパーコイルアイソフォーム
7. プラスミドの品質分析（アガロースゲル電気泳動、HPLCなど）は、最終pDNAが98±1.2％のスーパーコイル率と検出限外以下の不純物であった。
8. リポソームトランスフェクション実験は、ここで説明する精製pDNAがコントロールpDNAよりも高いトランスフェクション効率を持っていることを示しました。 したがって、この研究で提示された方法は、医薬品グレードのpDNAを製造するための主な要件を満たしている。 ラボ規模の準備から大規模な生産への移行は簡単です。
Figure 3. Plasmid purity analysis by HPLC. Plasmid purity was determined by anion-exchange HPLC on a MONO QTM 5/50 GL column. A linear gradient was performed at 0.5 mL/min by increasing the NaCl 0–1 M in 40 mM Tris/HCl, pH 8.0 for 10 CV at a flow rate of 0.5 mL/min. (A) plasmid sample purified by 2 M ammonium sulfate, (B) plasmid sample purified by 2.5 M ammonium sulfate, (C) plasmid sample purified by 3 M ammonium sulfate.
https://www.tandfonline.com/doi/full/10.3109/13880209.2012.703678
参考文献 16)
Improved downstream process for the production of plasmid DNA for gene therapy (2005)
HICにより、OCは最初のピークに、RNAは後のピークに、スーパーコイルであるpDNAは、その間に溶出される。
Figure 4. Performance of the HIC step.
Top: Elution profile of the HIC step (pRZ-hMCP1, 4.9 kbp). Main fractions are indicated by dashed lines. Bottom: Analyti- cal HPLC chromatograms of the HIC fractions; a) the first HIC peak contains impurities and open circular (oc) pDNA; b) the second HIC peak contains mainly supercoiled (ccc) pDNA; c) residual RNA and further im- purities elute when conductivity is suddenly strongly decreased. More strongly bound material is washed out of the column dur- ing regeneration (peak at the end of the HIC chromatogram
分析は、AEC。
http://www.actabp.pl/pdf/3_2005/703.pdf
