pDNAはスーバーコイル
参考文献 4)
4) Efficient Disruption of Escherichia coli for Plasmid DNA Recovery in a Bead Mill (2017)
概要 – 要約：ビーズミルによるpDNAの抽出に関する研究。総pDNA（pDNA（t））およびスーパーコイル状pDNA（pDNA（sc））について、抽出に関するモデルを開発を目的に、ミル頻度、セル濃度、およびビーズサイズの2つのレベル23要因を検討。
その結果は、応答曲面法によって分析した。
pDNA（t）の最適化抽出条件として、13.26 mg / g dcw（93.41％の回収率）、30 Hzのミル周波数、0.10〜0.25 mmのビーズサイズ、および20 g wcw / Lのセル濃度を決定。
pDNA（sc）の最適化抽出条件として、7.65 mg / g dcw（92.05％の回収率）、15 Hzのミル周波数、0.10〜0.25 mmのビーズサイズ、10 g wcw / Lのセル濃度を決定。
考察 – ビーズミルでの細胞破壊は、アルカリ処理と比較して、pDNA（t）およびpDNA（sc）の放出に効率的であることが証明された。
https://res.mdpi.com/d_attachment/applsci/applsci-08-00030/article_deploy/applsci-08-00030.pdf
アルカリ抽出
参考文献 5)
5) Hot-Alkaline DNA Extraction Method for Deep-Subseafloor Archaeal Communities (2014)
アルカリ処理と加熱を使用した新しいDNA抽出方法をの検討。 1 M NaOHで98°Cで20分間処理すると、さまざまな深さで収集された海底下の堆積物サンプル中の微生物細胞の98％以上が破壊されました。 しかし、DNAの完全性試験では、このような強アルカリ性および熱処理により、DNA分子がPCRでは増幅できない短い断片に切断されることが示されました。
その後、アルカリ条件と温度条件を最適化して、DNAの断片化を最小限に抑え、高い細胞破壊効率を維持しました。 最良の条件は、さまざまな深さからの海底下の堆積物サンプルで50〜80％の細胞破壊率を生み出し、完全な16S rRNA遺伝子（すなわち、約1,500 bp）の増幅に十分なDNAの完全性を保持しました。 最適化された方法では、従来のキットベースのアプローチを使用した抽出と比較して、テストしたすべてのサンプルでより高いDNA濃度も得られました。 リアルタイムPCRと細菌および古細菌の16SrRNA遺伝子のパイロシーケンスを使用した比較分子分析は、新しい方法が古細菌DNAとその多様性の増加をもたらしたことを示し、従来の方法よりも海底下の微生物群集のより良い分析範囲を提供することを示唆しています。
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3957647/
参考文献 6)
6) A continuous process to extract plasmid DNA based o Alkaline Lysis (2007)
ここで紹介するプロトコルは、アルカリ溶解プロトコルに基づくスケーラブルな連続プロセスでプラスミドDNAを抽出します。このプロセスでは、採取した細菌を2つの混合チャンバーに制御された速度で通過させて、溶解を行い、アルカリ度を制御します。得られた溶液は、一連の フィルターで汚染物質を除去し、エタノールで沈殿させます。 このプロセスは、粗プラスミドを取得する前にすべての遠心分離ステップを置き換え、より多くの量の需要を満たすために簡単にスケールアップできます。 この手順を使用して、プラスミドを抽出し、50分から90分で、4リットルの大腸菌培養物から精製することができます。 プラスミドの収量は80〜90mg/L 培養です。
細胞の形質転換→細胞増殖→プラスミドの抽出と精製。最も一般的な抽出方法はアルカリ抽出。連続プロセスに適用するには、pDNAの大規模な調製のためのアルカリ溶解法のスケールアップです。 細胞破壊の代替方法は沸騰溶解です。 しかし、このアプローチでは、pDNA収量と純度に一貫性がなく、メソッドも複雑です。最近、熱溶解プロトコルに基づく連続プロセスの開発と最適化の成功を報告しましたが、溶解後も遠心分離ステップが必要でした。アルカリ溶解手順によるpDNAの大規模抽出は、特に次の理由により、問題があると認識されています。 プロセスで使用される3つの溶液、それぞれ0.4M NaOH/C2コンテナ、2% SDS/C3コンテナ、3 M potassium acetate, 5 M acetic acid, and pH 4.8/C4コントなに地蔵しておく。Bacteria懸濁液(100 OD/TE buffer)とC2+C3のミックス液を混和してアルカリ溶解させ、その後、C3の溶液と混和することで、不純タンパク質とGenomeを沈殿化させる。濾液を回収し、70%EtOHで沈殿化させて濾過膜で沈殿を回収する。
Flow rate : 3cm/sec
遠心分離ステップを排除するために、0.2 μmの中空糸カートリッジを使用して細胞を回収。1）細胞溶解後の破片を除去し、プラスミドがエタノールで沈殿した後のRNA汚染を除去するための70μmナイロンフィルター。中空糸カートリッジはさまざまなサイズで製造できるため、適切なカートリッジを選択して、必要な最終容量を回収できます。 発酵細菌。 溶液IIIと混合した後、溶解したバクテリアを孔径が徐々に小さくなる4層のナイロンフィルター（375、186、122、70 μm）に通して、このサイズ範囲の破片やその他の不純物を除去します. 70μmのナイロンフィルターは、エタノール沈殿後のプラスミドとRNAの分離に最も効果的。
スペルミジン圧縮18、CTAB沈殿19、20、ゲルろ過12、磁気ビーズ精製21などのさまざまな後続の下流精製プロトコルに容易に採用できます。 このプロセスは、従来のアルカリ溶解の問題を回避し、DNAワクチン接種、非ウイルスベクターベースの遺伝子治療、RNAi発現コンストラクトおよびその他の関連する臨床および研究アプリケーションのニーズを満たすプラスミドDNAの自動生成のためのプラットフォームを提供します。 この連続システムは操作が簡単ですが、システムのセットアップと最適化には、接続、チューブサイズ、同期ポンプの調整を含む最初のステップが必要です。 流速、混合セルのサイズ、および振とう頻度は、新しい実験条件に合わせて最適化する必要があります。 発酵プロセスとバクテリアの収穫は、収穫されたバクテリアのアルカリ溶解から始まる以下の手順では説明されていません。 発酵は参考文献に記載されているように実施する必要があります。 15、および細菌は、参考文献に記載されているように、このプロトコルで使用するために収穫する必要があります。 15、TEの代わりにソリューションIを使用
https://www.researchgate.net/publication/5576598_A_continuous_process_to_extract_plasmid_DNA_based_on_alkaline_lysis