プラスミド抽出の原理
参考文献 7)
7) いまさら聞けないプラスミド抽出法の原理 (2011) – 生物工学第89巻 –
アルカリ変性の進み具合は、分子量の大きな染色体と、plasmid DNA(pDNA, スーパーコイルになっているものは特に安定的)とでは異なる。アルカリ抽出の原理を知ることができる。
1. covalently closed circular : ccc (物理的に最も安定)
2. open circular : oc
3. liner : lブラスミドベクターによってコピー数が1桁も違う
https://www.sbj.or.jp/wp-content/uploads/file/sbj/8909/8909_yomoyama_1.pdf
1. pUC, pBluescript, pGEM, pTZ, pBR322, pACYC, pSC101
プラスミド抽出の特許
参考文献 8)
8) US Patent for Plasmid DNA extraction process Patent – Justia Patents – プラスミドDNA抽出プロセス – FujifilmDiosynth Biotechnolgies UK Limited特許 (2010/07/29出願、US特許8889852)
フロースルー装置を用いて、95℃~120℃、10秒未満、5秒を超えて120℃超えないこと。pDNAは通常3kbp~4kbpの範囲。pH4~pH10,好ましくはpH7~9(0~100mM Tris-HCl)。カルシウムなどの細胞壁のカチオンを可溶化するEDATなどのキレート剤を含み得る。ボリオール(スクロースなど)によるpDNAの放出促進として、5%~10%を含み得る。界面活性剤X-100を1~10%を含み得る。カオトロープとして尿素を0.5~8M、好ましくは1~3M。細胞溶解剤リゾチームなどを必要としないが、必要に応じて使用し得る。
https://www.sbj.or.jp/wp-content/uploads/file/sbj/8909/8909_yomoyama_1.pdf
What is DNA?
参考文献 9)
9) What is DNA? – QIAGEN –
ウイルス、細菌のgenomeの長さ(bp)と分子量。
pDNAのAEX、Silica-membraneおよびマグネットSilicaによる精製。
https://www.qiagen.com/jp/service-and-support/learning-hub/molecular-biology-methods/dna/
プラスミド抽出
参考文献 10)
10) Plasmid vs. Genomic DNA Extraction: The Difference (2014)
ゲノムDNA抽出 (gDNA)は、最大限の抽出方法で行います。まず、酵母、植物、細菌の場合、溶解には、原形質膜を機械的に破壊する前に、強くて硬い細胞壁を酵素的に破壊することが含まれます。細胞壁は通常、細胞壁ペプチドグリカンを加水分解するリゾチームとセリンプロテアーゼプロテイナーゼKで消化されます。特定のグラム陽性種の場合、リゾスタフィンは酵素消化をさらに促進します。細胞壁の組成が異なる外来種には、異なる酵素を使用する必要がある場合があります。
その後、機械的な細胞壁破壊は、gDNA抽出のためのより普遍的な溶解方法として、ビーズビートがあります。0.1mmのガラスビーズまたは0.15mmの細かいガーネットビーズを使用して、ミル装置で行います。丈夫な糸状菌（例えば、アスペルギルスおよびフザリウム属）の場合、細胞材料は液体窒素で急速冷凍され、乳棒と乳鉢で粉砕された後、適切な溶解バッファーを含む溶液中で急速にボルテックスされます。
精製は、シリカへの結合を促進するグアニジン塩を添加したフェノール-クロロホルムまたはスピンフィルター膜技術を使用して行うことができます。
大腸菌の染色体は、細胞当たり約0.005ピコグラムにのぼる、サイズはわずか4.5メガバイトです。単一の開始コロニーからの典型的な一晩培養物は、約1-2× 109細胞/ mlを含みます。理論的には、これは、1mlの培養物が109個の細菌細胞あたり約5µgのgDNAを生成することを意味します。選択したアプリケーションに必要なDNAの量を計算するときは、これを考慮に入れてください。
プラスミドDNA(pDNA)はgDNAから分離しておく必要があるため、プラスミドDNAの抽出は少し注意が必要です。この分離はサイズに基づいており、適切な分離は適切な溶解方法の使用に依存します。
pDNA抽出の場合、細胞壁を酵素でかみ砕いたり、ガラスビーズで叩いたりするよりも、溶解をはるかに微妙にする必要があります。BirnboimとDolyは、1979年にアルカリ溶解によるプラスミドDNA抽出のための（事実上）普遍的な方法を発明しました。
溶解バッファーには水酸化ナトリウムとSDSが含まれており、プラスミドとgDNAを完全に変性させます（つまり、DNAを一本鎖に分離します）。過度の変性は不可逆的にプラスミドを変性させる可能性があるため、このステップを迅速に実行することが重要です。次に、サンプルを酢酸カリウム溶液で中和してプラスミドを再生します。これは、プラスミドとgDNAを分離するための鍵です。プラスミドは小さいため、簡単に再アニーリングしてdsDNAを形成できます。ただし、ゲノムDNAは長すぎて完全に再アニーリングできず、代わりに絡み合って相補鎖が分離されたままになる傾向があります。遠心分離中、gDNA（タンパク質に結合）はペレットを形成しますが、プラスミドDNAは可溶性のままです。このステップでは、gDNAが壊れやすいため、サンプルを激しくボルテックスしたり混合したりしないことが重要です。壊れたgDNAは、再アニーリングしてプラスミドと溶解するのに十分小さい場合があります。
pDNAの精製、次に、上清中のプラスミドDNAをエタノール沈殿するか、フェノール-クロロホルムまたはスピンフィルターを使用して精製します。スピンフィルターテクノロジーを使用している場合、中和バッファーにはグアニジン塩が含まれているため、ライセートはシリカに直接結合してさらに洗浄および溶出できます。得られたDNAは、ほとんどの下流の分子生物学アプリケーションにとって十分に純粋です。
トランスフェクションにプラスミドが必要な場合は、陰イオン交換精製が汚染エンドトキシンを除去するためのより良い選択です。より高速なシリカベースの精製セットアップを使用して、エンドトキシンの除去も可能です。高収量のプラスミドDNAを単離するには、対数増殖期後期または定常期初期の培養物を使用します。プラスミド維持のために適切な濃度の新鮮な単一コロニーと新鮮な選択抗生物質を使用して培養物を準備します。プラスミド抽出物にgDNAが混入する可能性があるため、細菌培養物を増殖させないことが重要です。
https://bitesizebio.com/1660/plasmid-v-genomic-dna-extractionthe-difference/