[Bio-Edu] Fcエフェクター活性 – ADCC活性を増強するafucosylation技術 [2020/05/22]

Bisecting GlcNac

β-1, 4-mannosyl-glycoprotein 4-β-N-acetylglucosaminyltransferase (GnT-III)は、普通CHO細胞では発現されません。

以下の2つの過剰発現のCHO細胞株は、抗CD20抗体GA101の宿主株として成功しています。最高レベルの(1) bisecting、(2) afucosylated glycansを、IgGで実現しました

• GnT-IIIの過剰発現
  • これのみでCHO細胞でのFcコアのフコシル化が減少
• Golgi α-mannosidase II (αManII)の過剰発現

GnT-IIIは、以下を触媒します。

• 以下を結合 (β1,4)させて、bisecting GlcNAcを作る
  • GlcNAc
  • N-glycansのtrimannosyl coreのβ結合型mannose

GDP-フコース de novo経路

[GDP-fucose de novo^(advice)経路]では、GDP-mannoseは、GKDMに変換される。

• GDP-mannose → (GDP-mannose-4,6-dehydratase)→ GDP-4-keto-6-deoxy mannose (GKDM)
• GKDM → (several downstream emzymatic reactions) →GDP-fucose

[バクテリア]では、GKDMはGDP-rhamnose形態に還元できます。GDP-rhamnoseは、細菌の一般的な細胞膜表面グリカンの1種です。

• GKDM → (GDP-4-keto-6-deoxy mannose reductase (RMD) )→ GDP-rhamnose

[CHO細胞]の細胞質内に、このRMDを異種発現することで、[GDP-Fucose de novo経路]がバイパスされるため、afucosylated IgGが作られます。最終産物であるGDP-rhamnoseは、GMDの阻害剤である可能性があります。

• GKDM → (GDP-4-keto-6-deoxy mannose reductase (RMD) )→ GDP-rhamnose

フコシル化阻害剤

遺伝子改変ではないアプローチとして、Okeley et al.による阻害剤研究があります。

• 2-fluorofucose
• 5-alkynylfucose

その作用機序は、以下のことが考えられます

• 細胞内GDP-fucoseの枯渇化 → de novo経路の遮断
• FUT8の阻害

植物細胞と後処理

植物細胞の利用

植物細胞では、以下の糖鎖が欠落します。

• α1,6-fucose
• β1,4-galactose
• α2,3-sialic acid

植物細胞では、通常、N-glycanは、(1)以下の糖鎖が付加されますが、(2)大きな糖鎖(哺乳動物でも稀に見られる)が付加されることもあります。

1. Man₃GlcNAc₂コアに以下のもので糖鎖修飾
   • β1,2-xylose ( mammalian では不要であり免疫原性がある)
     • コアxhloseは、献血ドナーから抗体が検出される
   • α1,3-fucose
     • この糖鎖を含むGnGnXF3構造(免疫原性)
     • コアα1,3-fucoseは、健常人献血ドナーから抗体が検出される
2. Large complex type N-glycans
   • Lewis^a構造
     • α1,4-fucose
     • β1,3-galactose

Strategy to overcome this immunogenicity

植物由来の糖鎖の免疫原性を克服するには、以下戦略があります。

• RNAi knockdown of α1,3-fucosyltransferase (FucT) in plant
• β1,2-xylosyltransferase (XylT) in plant
• FucT/XylT-knowckout lines

水草のLemna minorで作ったafucosylated anti-CD30 monolclonal antibody

• 得られたG0構造のこの抗体は、CHO細胞由来と比べてADCC活性が改善されました

Anti-HIV 2G12 from XylT/FucT – knockdown N.benthamiana

• 得られたG0構造は、N-acetylglucosamine末端において、以下の糖鎖を欠落してさせることができました
  • xylose
  • α1,3-fucose

付加糖鎖を後処理で除去

• endo-β-N-acetylglucosamidaseなどのEndo SでN-glycanを切断
• その後、exoglycosidaseであるfucosidaseで、core fucoseを除去
• 残ったmono-GlcNAcは、不均一であるので、desialylated complex型のoxazolineの存在下、Endo Sベースのglycosynthases(グリコシンセターゼ)によるtransglycosylation (糖転移反応)を行う
• この方法は、コストがかかります