トラディショナルな沈殿法
- 硫酸アンモニウム（硫安）沈殿法
- マイルドなタンパク質沈殿化法
- 飽和硫安濃度33%でIgGが沈殿、アルブミンは50%程度で沈殿する
- アセトン沈殿法
- 昔の血漿分解製剤で使用
- トリクロロ酢酸（TCA）沈殿法
- 酸性等電点を持つタンパク質に適用できる
- グリシン塩酸法
- TCA/アセトン沈殿法
- クロロホルム/メタノール
- SDSなどを除けるMS(質量分析)用のタンパク質の回収
- 酸性pH処理
- pH3~pH5にすることで、沈殿するものもあります。DNAなどの核酸が沈殿します。DNAでなくタンパク質も沈殿するものもあります
- DNAとタンパク質が共沈したとしても、その他の不純物と分離ができていれば、よしとします。後の処理でDNAとの分離を考えましょう
- 添加する酸は、タンパク質にマイルドな酢酸を使用します。塩酸は決して使ってはいけません。タンパク変性しやすいためです
- 食塩(NaCl)添加
- 3~5MのNaCl溶液を少ない量から適当添加していく方法で、スモールスケールの検討を行います。
- 酢酸を添加して酸性pHにしても沈殿が生じない場合に、追加的にNaClの添加をすると沈殿することもあります
- EtOH分画
- 血漿分画製剤で使用される実製造に使われている
- この技法は高度である。再現性を得るには、温度管理、pH管理、及び伝導度管理を厳密に制御する必要がある
参考
タンパク質精製は、SDS-PAGE分析で検出できる狭雑タンパク質の分離だけでは不十分です。endotoxnや核酸も不純物です。タンパク質から核酸を除去する目的ではないですが、沈澱法としてCTAB沈澱法についても以下に紹介します。この方法も昔から行われていた沈澱法です。
- CTABによるplasmid DNAとRNA/endotoxinの分離 2)
検討方法
マイクロサイズ法
沈澱化の検討は、200μL程度のガラス製のバイアルを使えば効率的です。Biacore用のサンプルチューブがいい感じに使えます。透明度と数百μLで検討ができて、サンプル量も効率的です。
操作法
- 100μLのサンプルをGlass vialに分注
- 酢酸原液を数μLずつ添加
- 別途、添加量とpHを確認しておく
- 酢酸は、タンパク質の溶解性を高めるので、入れすぎは逆効果です
- ですが、酢酸で低pHのタンパク質溶液にNaClを添加して塩濃度を高めると疎水性がより高まるためタンパク質が沈澱化しやすくなります
- 分子量が大きいて沈澱化効率は高まります
- 以上のことを踏まえて、沈殿化条件を決定していきます。
分析
- UVスペクトル(A200~700, NanoDropが便利)
- A260/A280比率は、タンパク質と核酸のコンタミ具合の指標
- SDS-PAGEによるタンパク質の純度分析
- 目的物の分子量を指標に評価
- Endotoxin分析 (option)
- LAL法 (Kit)
- DNA分析 (option)
- PicoGreen (Kit)
1) Glass vials
Borosilicate glass vials in a range of sizes and volumes. For use with Biacore systems.
沈殿化検討に使用する透明なガラスバイアル。ゴム栓も購入できるので、それを使えばしばらく保存が可能。検討である程度たまったら写真を撮ってから廃棄です。
https://www.cytivalifesciences.com/en/us/shop/protein-analysis/spr-label-free-analysis/accessories-vial/glass-vials-p-05546
2) Milligram scale parallel purification of plasmid DNA using anion-exchange membrane capsules and
a multi-channel peristaltic pump (2007)低濃度CTAB (0.1-4g/L) 沈殿法によるpDNAとRNA/Endotoxinの分離 : 2g/L or 10g/L CTAB/50mM NaCl溶液を添加し、Incubation20分, cfg(38,000xg 20min, 20℃)/pptを70% EtOHで洗浄し、0.6M NaCl, 25mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH7.4で氷冷下で溶解。
https://www.researchgate.net/profile/Stefan_Schmidt15/publication/6232344_Milligram_scale_parallel_purification_of_plasmid_DNA_using_anion-exchange_membrane_capsules_and_a_multi-channel_peristaltic_pump/links/59de01f545851557bde325bd/Milligram-scale-parallel-purification-of-plasmid-DNA-using-anion-exchange-membrane-capsules-and-a-multi-channel-peristaltic-pump.pdf?origin=publication_detail